TP1a Quantitative Proteomics mit nicht-radioaktiv markiertem Isotopenlabelling
Das stabile Isotopenlabelling in direkter Kombination mit der relativen quantitativen Massenspektrometrie stellt ein effektives und universell einsetzbares Instrument für die funktionelle Charakterisierung von komplexen biologischen Proteinproben dar. Mithilfe dieses methodischen Ansatzes können biologisch signifikante Unterschiede in der Expression von Proteinen direkt auf molekularer Ebene anhand massenspektrometrischer Datensätze identifiziert werden. Die Methoden des stabilen Isotopenlabellings lassen sich in zwei übergeordnete Klassen einteilen: das metabolische Isotopenlabelling und das chemische Isotopenlabelling. Während erstere eine etablierte Technik für Zellkultursysteme darstellt, stellt die universell einsetzbare chemische Derivatisierung von intakten Proteinproben mit stabilen Isotopen eine derzeit noch diffizile Technik dar. Ein zusätzlicher Vorteil der Isotopenmarkierung von intakten Proteinen besteht in der Möglichkeit, dass eine effektive Auftrennung biologischer Proteinproben mittels Gel-basierter und/oder chromatographischer Trennmethoden erzielt werden kann. Weiterhin birgt die im Rahmen dieses Projektes zu entwickelnde Labellingmethode große Vorteile für die relative quantitative Analyse von nur schwer zugänglichen Proteinklassen, wie z.B. Membranproteine, Proteine mit extremen pI-Werten und Molekulargewichten. Diese stellen aufgrund ihrer oftmals hohen Funktionalität wichtige Targets für die pharmazeutische als auch biotechnologische Industrie dar.
Zur Etablierung des entwickelten Proteinlabels in der quantitativen Proteomik sollen weiterhin folgende Aspekte untersucht werden: (1) Vollständigkeit und Reproduzierbarkeit der Labellingreaktion, (2) Stabilität sowie Spezifität des Labels, (3) Kompatibilität mit der 1D- und 2D-Gelektrophorese (4) Kompatibilität mit multidimensionalen chromatographischen Trenntechniken, (5) Optimierung der enzymatischen Spaltung isotopen-codierter Proteine, (6) Ionisation- sowie Fragmentierungsverhalten isotopenmarkierter proteolytischer Spaltprodukte bei der massenspektrometrischen Analyse. Die Robustheit des Isotopenlabels, die Anwendbarkeit der entwickelten Methode und die Genauigkeit der erzielten quantitativen Daten wird mit definierten Proteinstandards als auch durch die proteomische Analyse von Escherichia coli Produktionsstämmen und unterschiedlichen Saccharomyces cerevisiae Knock-out Stämmen validiert werden. Parallel dazu wird eine leistungsstarke und für das Proteinlabelling maßgeschneiderte Software entwickelt und etabliert werden, die es ermöglicht, auch sehr umfangreiche massenspektrometrische Datensätzen akkurat und in kürzester Zeit quantitativ auszuwerten. Mit der Etablierung dieser neuen Technologien sollen Laboratorien in Akademie und Industrie zukünftig in der Lage sein, die quantitative Proteomanalyse für ihre spezifischen Forschungsfelder effektiv nutzen zu können.
